线粒体复合体Ⅳ试剂盒说明书

微量法
正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
线粒体复合体Ⅳ又称细胞色素C氧化酶，也是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责催化还原型细胞色素C的氧化，并最终把电子传递给氧，生成水。
测定原理：
还原型细胞色素C在550nm有特征光吸收，线粒体复合体Ⅳ催化还原型细胞色素C生成氧化型细胞色素C，因此550nm光吸收下降速率能够反映线粒体复合体Ⅳ酶活性。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制：
试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂三：液体 1.5mL×1 瓶，-20℃保存；
试剂四：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、将匀浆 600g，4℃离心 5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11100g，4℃离心 10min。
4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅳ（此步可选做）。
5、步骤④中的沉淀即为线粒体，加入200uL试剂二和2uL试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于复合体Ⅳ酶活性测定。
测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2、样本测定
（1）工作液的配制：临用前将试剂五和试剂六依次转移到试剂四中混合溶解，置于37℃（哺
乳动物）或 25℃（其它物种）孵育5min；用不完的试剂 4℃可保存一周；
（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和200μL工作液，混匀，立即记录550nm
处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。
注意点： 若 ΔA 大于0.2，需将样本用试剂二稀释适当倍数（计算公式中乘以相应稀释倍数），
使 A1-A2 小于 0.2，可提高检测灵敏度。
复合体Ⅳ活力单位的计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T
=1099×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力 (nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V反总÷（ε×d ）×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T=222×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.444×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.1×10 ^-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T
=2198×ΔA÷Cpr
此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力 (nmol/min/g 鲜重 )=[ΔA×V反总÷（ε×d ）×10⁹]÷(W×V样 ÷V样总)÷T=444×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化降解1nmol还原型细胞色素C定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅳ活力(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.888×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2.1×10 ^-4 L；ε：细胞色素 C 摩尔消光系数，1.91×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。