微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
PPO（EC1.10.3.1）主要存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是一种含铜的氧化酶， 能使一元酚和二元酚氧化产生醌，从而引起褐化，与果蔬加工、茶叶品质和组培等密切相关。
测定原理：
PPO 能够催化邻苯二酚产生醌，后者在 525nm有特征光吸收。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：20mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：5mL×1 瓶，4℃保存； 试剂三：10mL×1 瓶，4℃保存；
粗酶液提取：
1、细菌、细胞或组织样品的制备：
细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃ 离心10min，取上清，置冰上待测。
组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、血清（浆）或果汁样本的处理：
按照血清（浆）或果汁体积（mL）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议取0.1mL血清
（浆）或果汁加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至525nm，蒸馏水调零。
2、样本测定（在 EP 管中依次加入下列试剂）

试剂名称（μL）	测定管	对照管
试剂一	200	200
试剂二	50	50
样本	50
煮沸的样本		50

37℃(哺乳动物)或 25℃（其它物种）中准确水浴10min 后迅速放入冰浴中冷却

试剂三

100

100

充分混匀，10000g，常温离心10min，收集上清，取200μL至微量石英比色皿或96孔板中，525nm 处检测测定管和对照管吸光度，计算 ΔA=A测定-A对照。
注意：每个测定管需要设一个对照管。可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行 1min 沸水浴处理。
PPO 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下1、血清（浆）或果汁PPO活性
单位的定义：每分钟每mL血清（浆）或果汁在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01 为一个酶活力单位。
PPO（U/mL）=ΔA×V 反总÷(V 液× V 样÷V 样总)÷0.01÷T =80×ΔA÷V 液
2、组织、细菌或细胞 PPO 活性
（1） 按样本蛋白浓度计算：
单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/mg prot）=ΔA×V 反总÷（V 样×Cpr）÷0.01÷T =80×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。
（2） 按样本鲜重计算：
单位定义：每分钟每g组织在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。PPO（U/g 鲜重）=ΔA×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =80×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算：
单位定义：每分钟每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中使525nm处吸光值变化0.01为一个酶活力单位。
PPO（U/104cell）=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T =0.16×ΔA
V 反总：反应体系总体积，0.4mL；V 液：加入血清（浆）或果汁体积，0.1mL；V 样：加入样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。