大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析

大肠杆菌的分离鉴定与耐药性分析
1、 细菌分离纯化：无菌采集肝脏划线接种于麦康凯琼脂培养基，伊美兰琼脂培养基中，37℃恒温培养12-24h，用普通培养基进行纯化培养；
2、 细菌形态特征：无菌挑去上述纯化培养菌，革兰氏染色镜检
电镜观察：FQ-180菌液培养7h后，3000r/min离心5min，弃上清，ddH₂O洗涤2次重悬，取15ul滴在Formver膜覆盖在铜网上，2min后滴加磷钨酸负染2min，待铜网烘干后，在投射电子显微镜下观察
3、 生化试验：将初步分离到的可疑菌落进行吲哚试验，MR试验，VP试验，淀粉E试验，枸橼酸钠利用试验，乳糖、麦芽糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、甘露醇发酵试验，产硫化氢试验，尿素酶试验，触酶试验，运动性试验，三塘铁斜面穿刺试验（或用ATB全自动生化鉴定系统和ID32E肠道菌鉴定试剂条进行生化试验）
4、 药敏试验：按照美国临床检验标准委员会（NCCLS）推荐的标准K-B纸片法进行实验操作和结果判断（所采用的抗生素见图1）
5、 血清型鉴定：采用玻板凝集反应对分离株进行血清型鉴定，先用多因子血清通过玻板凝集试验筛选可能的血清型，然后再与大肠杆菌单因子血清各10ul在玻板上混匀，30S内出现明显凝集者为阳性反应，同时以菌液与0.5%碳酸生理盐水混合物作对照，观察有无自凝现象
6、 PCR鉴定：将分离纯化后的菌株按照煮沸法制备细菌DNA模板，以大肠杆菌phoA基因的特异性引物进行PCR鉴定
7、 毒力基因与耐药性的关系：根据药敏试验的结果，针对药敏性较为普遍的抗生素的耐药基因情况，找出其规律，并研究独立基因与耐药性的关系，然后采用多重PCR方法检测耐药基因，如4种氨基糖苷类耐药基因aadA1，aac2，aac4，aphA3；3种四环素类耐药性基因tetA，tetC以及tetM的流行情况
8、 提取DNA及16s rDNA鉴定：提取细菌基因组DNA，并使用16s rRNA Bacterial Identification PCR kit的特异性引物进行扩增，最后进一步对PCR扩增的DNA克隆、测序并开展序列分析
9、 致病性试验：参照A.E.Williams等方法，设置16组试验组，1组阴性对照，实验组每株菌攻毒4只小组，按0.2ul/只腹腔注射菌液浓度为1*10⁹ef/ml，对照组4只小鼠注射等剂量的生理盐水，观察发病及死亡情况，无菌采集死亡小鼠肝脏、心脏进行分离鉴定
10、 鸡胚致死试验：将待测大肠杆菌分别划板，挑去平板上的单菌落，与LB液体培养基中37度摇床过夜培养，然后离心，经PBS洗2次，并用PBS悬液进行倍比稀释，取0.1ml稀释液经尿囊腔接种12日龄SPF鸡胚大约100-300CFU/只，每组10只，同时取0.1ml稀释液涂板，做细菌计数，对照分两组，一组直射PBS，一组不注射，计每日死亡数，质4d，计胚胎致死率
11、 病毒分离：收集病样加入青霉素（终浓度1000U/ml）和链霉素（终浓度1000U/ml），于4℃作用4h以上，取0.2ul接种于9-10日龄鸡胚羊膜腔，37℃培养72h，4℃过夜后收集羊水，每份样品接种3枚鸡胚，采集的羊水用1%鸡红细胞进行血凝试验，判断病毒是否成功分离，如果标本呈阳性，采用血凝抑制试验进一步坚定，标本呈阴性则继续自传3代
 
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