鼠骨髓中性粒细胞分离液 KIT 说明书
 
【产品规格】
 
200ml/Kit
 
【产品组成】
 
为方便广大用户使用，试剂内容如下：
 

	名称	产品编号	规格
A	分离液 1		200ml
B	样本稀释液	2010C1119	200ml
C	清洗液（赠品）	2010X1118	200ml
D	红细胞裂解液（赠品）	NH4CL2009	100ml
E	红细胞沉降液（6%羟乙基淀粉）	HES-TBD550-80	80ml
F	试剂 F	F2013TBD	200ml
G	说明书		1 份

 
【实验前准备】
 
适用仪器：最大离心力可达 1200g 的水平转子离心机
 
【检验方法】
 
全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。
 

• 首先制备骨髓单细胞悬液，制备方法详见“鼠骨髓冲洗单细胞悬液制备技术”。

 

• 取一支 15ml 离心管，先加入分离液 1：3ml，后加入 80%浓度分离液 1 溶液（分离液 1：

 
样本稀释液=4：1 的混合液）：1.5ml，形成梯度界面。
 

• 用吸管小心吸取细胞悬液样本加于分离液之液面上，650-800g ，离心 20-30min（注：如改变样本及分离液用量，需相应调整离心力及离心时间，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果）。

 

• 离心后，稀释液层下出现两层白色环状细胞层，取下层白色环状中性粒细胞层（会有少量红细胞混杂），加 3-5 倍体积清洗液混匀，400g 离心 10min。

 

• 离心后弃上清，后可通过两种方法去除红细胞。

 
方法一：细胞沉淀用红细胞裂解液去除红细胞（具体方法参见“红细胞裂解液说明书”）。
 
方法二：
 
1.  细胞沉淀用 1ml 红细胞沉降液重悬，加于 3ml 分离液 1 之液面上，400g 离心 20min。
 

• 取白色环状细胞层，加 3-5 倍体积清洗液混匀，250g 离心 10min，重复洗涤 2-3 次，获得目的细胞（如仍有少量红细胞混杂，使用红细胞裂解液去除红细胞）。

 
分离图例
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
【注意事项】
 

• 全过程样本、试剂及实验环境均需在 20±2℃的条件下进行。为获得最佳的实验结果，需在取样 2h 内进行实验。

 

• 本实验最好不使用高聚合材质（如聚苯乙烯）的塑料制品，应使用无静电、低静电离心管及未经碱处理过后的玻璃制品，因为静电作用将导致细胞贴壁、碱处理的玻璃表面会变成毛面，影响细胞分离效果。

 

• 分离液用量大于骨髓单细胞悬液样本量时，分离效果更佳。

 

• 如实验后细胞得率或活性过低，请联系技术支持以寻求帮助.

 

• 请勿使用具有红细胞保护成分的抗凝剂，否则影响分离效果（离心后，红细胞不能完全沉至离心管底部）。

 
【储存条件及有效期】
 
常温保存，有效期 2 年。本品易感染细菌，需无菌条件操作。无菌条件下操作，启封后置常温保存。如 4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。
 
【参考值（参考范围）】
 
本实验中性粒细胞提取率大于 80%。
 
【相关实验技术方案】

• 骨髓冲洗单细胞悬液制备技术。

 

• 所获得中性粒细胞的培养技术。

 

• 所获得中性粒细胞的核酸提取技术。

 

• 所获得中性粒细胞的鉴定方法A.流式细胞技术B.免疫组化技术

 
C.原位杂交技术
 
D.PCR 技术
 
【可能存在的问题及解决方法】
 
1. 由于血液粘度、细胞密度等差异可能造成的问题及解决方案如下表所示：
 

出现情况	出现原因	建议解决方案
离心后目的细胞存在于血浆层或稀释液层	转速过小或离心时间过短	适当增减转速
离心后目的细胞存在于分离液中	转速过大或离心时间过长
离心后白环层弥散	细胞密度过大	调整细胞密度
离心后白环层太浅或看不见	细胞密度过小

 

• 本分离液分离细胞的原理为密度梯度离心，其密度与温度、大气压等密切相关。不同地区客户可根据当地情况对离心条件进行适当调整。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。

 

• 本分离液依照国际标准，全部使用药用级原料，性能指标与国产同类产品略有不同，可能出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心转速。

 
注：在对离心条件进行调整时，离心转速的加减以 50-100g 为基数，直至达到最佳分离效果，
 
离心力最小不得小于 400g，最大不得大于 1200g。离心时间以 20-30min 为准。