上海研谨生物专业销售（pBM18A Toposmart Cloning Kit 克隆试剂盒）欢迎您咨询订购！
产品信息：
产品介绍：
pBM18ATopotsmart克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中，不仅适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。阳性克隆可用M13F(-47)和M13R(-48) 引物进行菌落PCR鉴定。SmaI和XhoI单酶切可将克隆片段酶切出来。载体的多克隆位点两侧具有SP6和T7 RNA聚合酶启动子序列， 可用于体外RNA转录。载体不含LacZ基因，不能进行蓝白斑筛选。
2. PCR 引物 5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。
3. 载体采用了新的制备工艺，无需蓝白斑筛选。
4. 载体具有氨苄青霉素抗性。操作步骤
产品信息：
| 组分 | JCL073-01 (20次) | JCL073-02 (20次×3) |
| pBM18A Vector (20ng/ml ) | 20ml | 20ml×3 |
| 10×Toposmart | 20ml | 20ml×3 |
| Control Insert LacZα | 5ml | 5ml |
| M13F(-47) Primer | 0.1OD | 0.1OD×3 |
| M13R(-48) Primer | 0.1OD | 0.1OD×3 |
pBM18ATopotsmart克隆试剂盒利用痘苗病毒的拓扑异构酶I(Topoisomerase I)的切割再连接的特点将片段克隆到载体中，不仅适用于克隆由Pfu、KOD、Xerox、Phusion和Q5等高保真DNA聚合酶扩增的平末端PCR产物，也可克隆由Taq、Tth和klenTaq等DNA聚合酶扩增的带A尾的PCR产物。阳性克隆可用M13F(-47)和M13R(-48) 引物进行菌落PCR鉴定。SmaI和XhoI单酶切可将克隆片段酶切出来。载体的多克隆位点两侧具有SP6和T7 RNA聚合酶启动子序列， 可用于体外RNA转录。载体不含LacZ基因，不能进行蓝白斑筛选。
产品特点：
1. 使用各种DNA聚合酶扩增的PCR产物。2. PCR 引物 5’端不能进行磷酸修饰，普通商业化引物即可。
3. 载体采用了新的制备工艺，无需蓝白斑筛选。
4. 载体具有氨苄青霉素抗性。操作步骤
1. 连接反应
按下表，在一个 0.2ml PCR 管中依次加入| 成分 | 体积 |
| DNA 片段 | 0.5-8ml |
| pBM18A Vector | 1ml |
| 10×Toposmart | 1ml |
| 补水至总体积 | 10ml |
加完试剂后，轻轻混匀低速离心，使溶液集中在管底。注意：此步骤不要在低温条件下（冰水浴）上操作。
注意：DNA 片段的用量见下表
室温下（20-30℃）反应时间 5-30 分钟，如果室温较低，推荐使用 PCR 仪控温。可以设置 25℃反应 5-30 分钟。如果 PCR 产物电泳检测仅有很锐利明亮的条带， 无引物二聚体和非特异性条带存在，可直接取 0.5-1ml 的 PCR 产物原液进行克隆。
20-30 分钟。
（2）42℃水浴中热击 30 秒。
（3） 立刻置于冰水浴中 2 分钟。
（4） 加入 300-500µl 无菌的不含抗生素的SOC 或 LB，37℃，200-250rpm 振荡培养 60 分钟。
注：小于 2kb 片段可以不复苏，直接涂平板。
（5） 吸取 200ml 菌液涂布。为了得到更多的菌落，可以先 4000rpm 离心 1 分钟，去掉部分上清，用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后37℃培养过夜（12-16 小时）。
5. 阳性重组子的鉴定菌落 PCR
（1） 菌落PCR方法鉴定阳性克隆
2. 反应温度及片段要求
室温下（20-30℃）放置 5-30 分钟，然后将离心管放置在冰上。如当天不进行转化实验。请将连接产物置于-20℃保存。注意：DNA 片段的用量见下表
| 片段大小（bp） | 最佳用量（ng） |
| 100-1000 | 20-50 |
| 1000-2000 | 50-100 |
| 2000-5000 | 100-200 |
3. 阳性对照反应
取 1ml 试剂盒提供的 1kb 长度的对照片段 LacZ 基因 α肽片段进行克隆，转化具有α互补功能的大肠杆菌感受态细胞（如 DH5α,TOP10,Mach1T1 等）。菌液涂布在含有 IPTG 和 X-gal 的 LB 氨苄平板上，次日蓝色菌落为阳性克隆，说明有片段插入，白色菌落为空载体。4. 转化
（1）取 5ml 连接产物到 50-100ml 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴20-30 分钟。
（2）42℃水浴中热击 30 秒。
（3） 立刻置于冰水浴中 2 分钟。
（4） 加入 300-500µl 无菌的不含抗生素的SOC 或 LB，37℃，200-250rpm 振荡培养 60 分钟。
注：小于 2kb 片段可以不复苏，直接涂平板。
（5） 吸取 200ml 菌液涂布。为了得到更多的菌落，可以先 4000rpm 离心 1 分钟，去掉部分上清，用移液器轻吹菌体，充分悬浮菌液，取全部菌液涂布，然后37℃培养过夜（12-16 小时）。
5. 阳性重组子的鉴定菌落 PCR
（1） 菌落PCR方法鉴定阳性克隆
① 用10ml吸头挑选克隆至预先加有10ml无菌水或LB培养基的PCR管中， 吹打混合。
② 25ml PCR反应体系：取2ml细菌悬液为模板、加入5mM 浓度的M13F(-47)、
M13R(-48)各1ml进行PCR扩增。
③PCR扩增条件：95℃预变性5分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性10秒钟，55℃退火10秒钟，72℃延伸（ 根据片段的大小决定延伸时间，通常每1min/1kb）X秒，30个循环，72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，有强烈的明显条带的克隆为重组体，与插入片段大小相近【M13F(-47)、M13R(-48)引物在克隆位置的两侧，所以PCR 扩增出的DNA的长度比插入片段大229bp】可视为阳性克隆。菌落PCR 方法鉴定重组子时一定要设立一个不加菌液的阴性对照。
（2） 测序：用M13F(-47)、M13R(-48)通用引物对阳性质粒进行测序分析。
pBM18A载体图谱7. 常见问题分析
(1) 重组子克隆菌少，或阳性率低：感受态效率低，使用转化效率>5×107cfu/µg 的感受态细胞
(2) 连接反应在低温下（如放碎冰上）操作，应该在室温下操作。
(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推荐量加入。
(4) PCR 纯度低，重新扩增或重新纯化 PCR 产物。
(5) PCR 质量低，切胶时在紫外下照射时间长，需重新制备。
(6) PCR 扩增结束后，应该再延伸 5-10 分钟，确保片段延伸完全。
(7) 转化后没有复苏培养，可以加入SOC 或 LB，培养 60 分钟。克隆基因可
② 25ml PCR反应体系：取2ml细菌悬液为模板、加入5mM 浓度的M13F(-47)、
M13R(-48)各1ml进行PCR扩增。
③PCR扩增条件：95℃预变性5分钟（裂解细胞，失活核酸酶），94℃变性10秒钟，55℃退火10秒钟，72℃延伸（ 根据片段的大小决定延伸时间，通常每1min/1kb）X秒，30个循环，72℃后延伸5分钟。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，有强烈的明显条带的克隆为重组体，与插入片段大小相近【M13F(-47)、M13R(-48)引物在克隆位置的两侧，所以PCR 扩增出的DNA的长度比插入片段大229bp】可视为阳性克隆。菌落PCR 方法鉴定重组子时一定要设立一个不加菌液的阴性对照。
（2） 测序：用M13F(-47)、M13R(-48)通用引物对阳性质粒进行测序分析。
6.
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(1) 重组子克隆菌少，或阳性率低：感受态效率低，使用转化效率>5×107cfu/µg 的感受态细胞
(2) 连接反应在低温下（如放碎冰上）操作，应该在室温下操作。
(3) PCR 片段加入量太多或太少，按照推荐量加入。
(4) PCR 纯度低，重新扩增或重新纯化 PCR 产物。
(5) PCR 质量低，切胶时在紫外下照射时间长，需重新制备。
(6) PCR 扩增结束后，应该再延伸 5-10 分钟，确保片段延伸完全。
(7) 转化后没有复苏培养，可以加入SOC 或 LB，培养 60 分钟。克隆基因可
能对宿主菌有毒性，比如某些编码膜蛋白和DNA 结合蛋白的基因，某些启动子和调节序列基因，或含有倒置或串联重复序列的基因，选用室温过夜培养平板，或换用低拷贝质粒载体。
载体序列：
>pBM18A 1952bp AAAGGCCCACCCGTGAAGGTGAGCCAGTGAGTTGATTGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTA AAACGACGGCCAGCCAATTGAAGCTATTTAGGTGACACTATAGATATCGAGCTCGAGGATCCATGGTA
CCCGGGCGTGTCG CGACACGCCCGGGTCTAGACTGCAGCTCGAGGCATGCAAGCTTTGCCCTATAGTGAGTCGTATTACAATTCCATCCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCGT CCATAGCAGAAAGTCAAAAGCCTCCGACCGGAGGCTTTTGACTTGATCGGCACGTAAGAGGTTCCAAC TTTCACCATAATGAAATAAGATCACTACCGGGCGTATTTTTTGAGTTATCGAGATTTTCAGGAGCTAA GGAAGCTAAAATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTC CTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTG GGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCC AATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGC AACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCAT CTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGC CAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATC ATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACC ACGATGCCTGTAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTC CCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTC CGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCA CTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA TGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAATGAGGGCCCAAAT GTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCC CCTGACGAGCATCACAAAAATCGATGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATA CCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACC TGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCG GTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTT ATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTG GTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTAC GGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTCGGAAAAAGAGTT GGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGAT TACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATTTTCTACCGAAG
本产品仅供研究，不用于临床诊断
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