酪蛋白酶谱MMP（3/10）检测实验
 
实验方法介绍
基质金属蛋白酶(MMP)酪蛋白酶谱法(casein-zymography) 电泳分析试剂是一种旨在通过酪蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的白色清晰的基质金属蛋白酶条带,根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权wei而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取样品(动物、人体、植物、昆虫等)、培养 上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶- 1, 3,7以及12等活性及其抑制剂的检测。
 
实验技术背景
基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinases; MMPs) 是类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属(锌、钙)离子而得名。迄今为止发现的MMPs至少有28种,几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质(xtracellular matrix)成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入(blastocyst)、血管形成、 组织再吸收(tissue resorption)、 疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等根据降解的底物不同可将MMPs分为4大类:
 
(1)胶原酶: MMP1、MMP8、MMP13 主要消化I、II、 II、 VII、 X型胶原和蛋白多糖;
 
(2)明胶酶(IV型胶原酶) : MMP2、MMP9,又称明胶酶A、B, 主要消化IV、V. VII、 X型胶原和弹性纤维;
 
(3)基质溶解素: MMP3、MMP7、MMP16、MMP11,主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、II、IV、V. VII、IX胶原及MMP1、 MMP8、 MMP9;
 
(4)膜型金属蛋白酶: MT1-MMP、 MT2-MMP、 MT3-MMP，主要作用于明胶、IV型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs 以无活性的酶原(proenzyme) 形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs, 形成瀑布效应。酪蛋白酶谱法(casein-zymography) 电泳分析技术使用-酪蛋白作为酶的底物，具有简便,无需抗体，同步观察多种酶以及活化与否的优势。
 
研谨生物酪蛋白酶谱法MMP3/10检测实验服务案例介绍
 
本实验采用酶谱法(zymography)检测MMP-3、MMP-7、 MMP-10活性，Zymography是一种基于SDS-PAGE电泳的蛋白酶检测方法，其灵敏度可达1 nM (10~100 pg),高于ELISA方法。通过制备加有胶原酶底物的SDS-PAGE凝胶，含蛋白酶的样品在凝胶进行电泳，电泳结束后取出凝胶与酶反应Bufer孵育,凝胶进行考马斯亮蓝染色与脱色。凝胶中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置,蛋白酶将降解凝胶中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮区域,从而能同时指示MMP-3/10的大小位置(酶谱)及活性。
 
样品准备要求
 
1)血浆/血清/上清或体液样品准备:血浆或血清样本加入1/10体积的柠檬酸钠，1000rpm离心20分钟， 留取上清，以BCA法测定蛋白浓度，测定浓度以后，取约30ug蛋白上样进行电泳检测。样本准备后可暂时4°C保存，不立即测定的样品需 -70°C保存,但不宜超过10天。
 
2)组织样本准备:取100mg新鲜组织以2m匀浆液进行匀浆(匀浆剂: 0.1M Tris/ HCI/pH 7.4 ,0.5%TritonX-100, 0. 1mg/ml PMSF)，12000g 4°C离心5分钟，移取上清层至另一新的1m离心管待测，取30ug蛋白上样进行电泳检测。样本准备以后，样品可暂时4°C保存,不立即测定的样品需 -70°C保存,但不宜超过10天。
 
3)细胞样本准备:取1个6孔板细胞(每孔 细胞量约2*106个细胞)， 离心后以500u匀浆液进行超声匀浆(匀浆剂: 0.1M Tris/HClpH 7. 4 ,0.5% TritonX-100，0.1mg/ml PMSF)，12000g 4°C离心5分钟，移取上清层至另一新的1m离心管待测，取30ug蛋白 上样进行电泳检测。样本准备以后，样品可暂时4°C保存，不立即测定的样品需-70°C保存，但不宜超过10天。
 
实验须知
1)实验用试剂由实验室免费提供;
2)检测系统含阳性参照或内参;
3)提供原始胶片;
4)实验委托方只需提供检测样品。
Elisa免费代做
蛋白实验：Elisa免费代做  Wb代做  蛋白双向  蛋白相互作用
病理实验：HE染色  透射电镜  扫描电镜  油红O染色  激光共聚焦  石蜡切片
免疫细胞化学ICC    免疫组化IHC   免疫荧光染色
 
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